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  • 蛋白质纯化方法及原理(蛋白质纯化的基本步骤及原则)
蛋白质纯化方法及原理(蛋白质纯化的基本步骤及原则)
蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。要研究某一个特殊蛋白质,首先就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。
产品类别: 蛋白质纯化方法及原理(蛋白质纯化的基本步骤及原则)
产品名称: 蛋白质纯化方法及原理(蛋白质纯化的基本步骤及原则)
更新时间: 2022-10-15 10:24:22
产品型号: 蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。要研究某一个特殊蛋白质,首先就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。

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蛋白质纯化方法及原理(蛋白质纯化的基本步骤及原则)


  蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。要研究某一个特殊蛋白质,首先就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。蛋白纯化方法主要是利用不同蛋白质间的相似性与差异,依据蛋白间的相似性可以去除非蛋白物质,再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。在本文中,我们将介绍2种常用的蛋白纯化的方法。

  1、自制的简易柱子,直径约为1cm,长度约为2cm,在柱子的下端加入蒸馏水,并关闭柱子的出口。

  2、将琼脂糖凝胶倒入柱子,让填料自然沉降,依次用二到五倍的柱子体积的无菌水、8mol/L的尿素、无菌水洗柱子。

  3、缓慢加入5ml的硫酸镍,至柱子的颜色由白色变为蓝色,待蓝绿色收集液体滴下来为止。

  4、用二到五倍体积的PBS缓冲液平衡柱子,再将粗蛋白样品进行上样,用梯度浓度50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L、250mmol/L咪唑进行过柱,流速约为1ml/min。

  5、以每个浓度用1.5ml的Eppendorf收集八管,再用二到五倍体积的无菌水洗柱子,再用二到五倍的50mmol/L的EDTA洗柱子,除去NiSO4,待至无色状态

  6、用多倍体积的无菌水进行洗柱子,将手机液10%的分离胶进行SDS—PAGE分析。

  离子交换层析

  1、将macro prep High-Q强阴离子交换填料混匀,吸取16 ml于小烧杯中,静置待填料沉降至烧杯底部,吸取并弃去上清。

  2、在烧杯中加入4倍体积的ddH2O,混匀,静置,沉降后去上清。重复2次以充分洗去保存填料中的乙醇。

  3、在空柱中加入柱体积10%的装柱缓冲液,静置除去可能存在于柱壁和柱底部薄膜上的气泡。

  4、以1:1(v/v)比例在烧杯中加入装柱缓冲液(20 mM sodium phosphate,pH 7.0,1 M NaCl),混匀。用玻璃棒引流加入至柱中,并用装柱缓冲液填满剩余柱体积。静置30 min。

  5、待填料均沉降至柱底部后,将适配器以较小的倾斜角度插入至柱中填料顶部。

  (1)打开柱低端开口,以最大流速10 ml/min泵入装柱缓冲液,压实填料。

  (2)缓慢降低缓冲液的流速,并将装柱缓冲液更换成结合缓冲液(20 mM sodium phosphate,pH 7.0)。

  (3)设定蛋白纯化程序,使用15倍柱体积缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。

  (4)收集流出液,进行SDS-PAGE检测。

  (注意:所有层析所需的溶液以及蛋白样品都需要使用0.22μm的滤膜过滤,少量的溶液或蛋白样品需要可使用针头滤器,大量的溶液需要使用506的溶剂过滤器进行过滤。)




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